Dinámica de proteínas del estresosoma de listeria monocytogenes en repuesta a estrés osmótico y el ambiente intracelular eucariota

Resumen

Listeria monocytogenes es un patógeno bacteriano Gram-positivo que resiste de manera eficiente al estrés ambiental. Sigma B (SigB), un factor de transcripción de repuesta al estrés, es activado por un complejo multiproteico, el estresosoma, para regular la expresión génica en condiciones de estrés. La estructura del estresosoma, inferida del estudio de complejos ensamblados in vitro, consiste en las proteínas centrales RsbR (aquí renombrada como RsbR1), sus parálogos, RsbS y la quinasa RsbT. Se ha propuesto que el complejo activo se asocia a la membrana interna de la bacteria para captar la señal de estrés. Esta señal es transferida mediante etapas de fosforilación de RsbR1 / RsbS por RsbT y la posterior liberación de RsbT. A pesar de la información obtenida de los análisis estructurales y de las interacciones proteína-proteína caracterizadas in vitro dentro del complejo RsbR1-RsbS-RsbT, queda mucho por aprender sobre la dinámica de estas interacciones y cómo son moduladas in vivo en respuesta al estrés. En esta tesis, se ha estudiado en L. monocytogenes en crecimiento la localización celular de los principales componentes del estresosoma, sus interacciones y el estado de fosforilación en ausencia / presencia de estrés osmótico. Inesperadamente, algunas de estas proteínas se han detectado principalmente en el citosol y con estados de fosforilación que permanecieron inalterados en respuesta a la hiperosmolaridad. La actividad quinasa de RsbT sobre RsbR1 / RsbS y su requerimiento a activar SigB en respuesta al estrés osmótico se han demonstrado también in vivo. La proteína RsbR1, principalmente citosólica, interactúa con RsbT, mientras que esta interacción disminuye en la membrana cuando están presentes los parálogos de RsbR1 (RsbR2, RsbR3 y RsbL). Estos resultados sugieren que in vivo el complejo activo RsbR1-RsbS-RsbT se forma sólo de forma transitoria y que los parálogos de RsbR1 asociados a la membrana podrían modular negativamente su ensamblaje. En este trabajo también se describe la distribución celular de las proteínas del estresosoma durante la interacción de L. monocytogenes con las células eucariotas. Aunque se conocía un papel de SigB en la invasión de células epiteliales, los resultados obtenidos apoyan por primera vez una activación progresiva de SigB in vivo durante el crecimiento intracelular de L. monocytogenes. Esta activación podría estar modulada por los parálogos de RsbR1 durante la entrada en las células epiteliales. El último capítulo se ha centrado en la caracterización de cambios de la pared celular en respuesta al estrés osmótico y el papel que juegan SigB y el estresosoma en esta remodelación. Se observaron niveles más altos de ciertas proteínas de superficie ancladas a la pared que son reguladas por SigB en respuesta a la hiperosmolaridad. Estas proteínas de superficie, así como SigB y sus reguladores, RsbR1 y RsbX, modularon la arquitectura de la envuelta al observarse diferencias en la unión de la bacteria a lectinas y glucanos.