Modulación de los mecanismos de activación del macrófago durante la infección por "Trypanosoma cruzi" invasión celular e inhibición de la maduración del macrófago

Abstract

MODULACIÓN DE LOS MECANISMOS DE ACTIVACIÓN DEL MACRÓFAGO DURANTE LA INFECCIÓN POR Trypanosoma cruzi: INVASIÓN CELULAR E INHIBICIÓN DE LA MADURACIÓN DEL MACRÓFAGO. Trypanosoma cruzi es un protozoo intracelular transmitido a hospedadores vertebrados e invertebrados por un insecío vector perteneciente a la familia Reduviidae (Chagas, 1909). La infección en humanos genera la Enfermedad de Chagas, clasificada en dos fases, la fase aguda caracterizada por parásitos circulantes en sangre, fiebre e inflamación local; y la fase crónica caracterizada por pocos parásitos circulantes pero progresiva degeneración de la función cardiaca o intestinal. La respuesta inmune frente a la enfermedad es una respuesta celular, en las que las citoquinas juegan un papel importante en la regulación de la parasitemia. La activación de la respuesta Th1 implica la activación de monocitos (célula diana durante la infección de T. cruzi) y consecuente actividad microbicida que impide la replicación del parásito intracelular. Pero el exceso de respuesta Th1 es regulado por la respuesta Th2, de tal manera que el balance entre ambas determina la resistencia o susceptibilidad a la infección. Durante la regulación de la respuesta inmune es determinante el efecto de la infección en la activación e inhibición de distintas vías de señalización y de la maduración del macrófago. Durante este proceso T. cruzi está interaccionando con distintos receptores de la superficie del macrófago que señalizan la producción de moléculas relevantes en la respuesta inmune, como son los Receptores Toll like 2 y 4 implicados en infecciones parasitarias y los Receptores de la Superfamilia de SLAM. La interacción con receptores de la membrana del macrófago también activa distintos mecanismos implicados en el proceso de invasión, necesario para la replicación intracelular y supervivencia de T. cruzi en el macrófago. T. cruzi infecta células no fagocíticas por un proceso activo dirigido por el propio parásito en el cual induce la formación de lisosomas en la zona de entrada, pero no hay todavía evidencias sobre la entrada del parásito en macrófagos que podría estar relacionada con la vía fagocítica convencional Rab-GTPasa dependiente. Todavía no están claros los mecanismos que T. cruzi utiliza para evadir la respuesta inmune y evitar la degradación por fagocitosis. OBJETIVOS Estudiar la activación y/o inhibición de distintas vías de señalización implicadas en el proceso de invasión y en la regulación de la activación y maduración de macrófagos infectados por T. cruzi, durante la fase aguda de la Enfermedad de Chagas. Hemos estudiado la respuesta a la infección in vivo usando ratones BALB/c y la cinética de infección in vitro de monocitos/macrófagos para determinar las rutas de señalización implicadas. Utilizamos ratones como modelo in vivo porque las cepas de parásito que infectan humanos son también patogénicas en el ratón. RESULTADOS Y DISCUSIÓN El primer punto fue estudiar el análisis molecular de la activación de macrófagos durante la fase aguda en ratones BALB/c infectados in vivo con tripomastigotes sanguíneos de T. cruzi durante 7, 14, 21 y 28 días. Analizamos en macrófagos perifonéales de ratones infectados y control la producción de diferentes moléculas requeridas para la eliminación de parásitos intracelulares, como TNF, COX-2 e ¡NOS. La infección indujo la producción de las tres moléculas con un pico de producción de TNF que coincidió con el título más alto de parásitos en sangre. La infección también activó la respuesta celular Th1 durante la fase aguda. Como esta respuesta normalmente es regulada en macrófagos por quinasas como p38MAPK y PI3K, estudiamos la activación/fosforilación de estas quinasas durante el curso de la infección. La infección inhibió la fosforilación basal de PI3K pero activó p38MAPK e indujo la expresión de ¡NOS al mismo tiempo que se observó la expresión de COX-2 tanto in vivo como in vitro. El segundo objetivo de la tesis fue determinar si T. cruzi utiliza el mecanismo de endocitosis dependiente de proteínas Rab durante la entrada al macrófago. Analizamos el efecto de la infección de T. cruzi en la activación de Rab5 pues es una de las primeras moléculas implicadas en regular la maduración del fagosoma. Determinamos que la infección induce la unión de Rab5 a los fagosomas tempranos que contienen parásito vivo a través de la activación de PI3K, que fue esencial para la entrada de T. cruzi en el macrófago. Además, utilizando varios ratones genéticamente deficientes, encontramos que algunos receptores de la superficie del macrófago, como TLR2, TLR4 y SLAM(CD150), estaban implicados en la patogénesis de la infección por T. cruzi en macrófagos. La activación de Rab5 y fusión de endosomas tempranos fue mediada por TLR2 y SLAM pero fue TLR4 independiente. Finalmente, analizamos la presentación de antígeno durante la infección de T. cruzi. La expresión de moléculas co-estimuladoras CD80/CD86 en macrófagos peritoneales de ratones BALB/c infectados durante 7,14, 21 y 28 días fue fuertemente inhibida al final de la fase aguda. Sin embargo, la expresión de MHCII fue incrementada transitoriamente con el pico de parasitemia pero posteriormente disminuyó a los niveles básales de expresión. Este efecto en la expresión de moléculas co-estimuladoras también fue observado con infecciones in vitro y fue independiente de la activación de p38MAPK. Los experimentos de infección in vitro también sugieren que la forma replicativa intracelular de T. cruzi está inhibiendo la expresión de MHCII en respuesta a IFN , evitando la activación de células T y la expansión clonal.