Caracterización química y bioactividad de compuestos producidos por levaduras y derivados de la vid.

Zusammenfassung

En los últimos años, la melatonina ha sido identificada en diversas matrices alimentarias, principalmente de origen vegetal como frutas (uvas, fresas) y verduras (tomates, pimientos). Sin embargo, ha generado un notable interés el hecho de detectar melatonina en alimentos fermentados como el vino o la cerveza. Todo parece indicar que la presencia de esta molécula en alimentos fermentados está directamente relacionada con el metabolismo de las levaduras, especialmente del género Saccharomyces cerevisiae, durante los procesos fermentativos. La melatonina es bien conocida en mamíferos como neurohormona sintetizada por la glándula pineal y su función principal es la de regular los ciclos circadianos de sueño/vigilia dependiendo de las condiciones de luz y oscuridad. Además, también ha mostrado otras propiedades bioactivas como molécula antioxidante, siendo una excelente captadora de especies reactivas de oxígeno. Por otro lado, ha sido también descrita en plantas y en microorganismos, aunque en este caso sus funciones no están completamente dilucidadas. La melatonina se forma a partir del aminóacido triptófano, que pertenece al grupo de aminoácidos aromáticos junto a la tirosina y la fenilalanina. Su proceso de formación en mamíferos contempla como intermediarios moléculas como el 5-hidroxitriptófano, la serotonina o la N-acetilserotonina. En plantas, la triptamina también puede formar parte de la ruta de formación de la melatonina en lugar del 5-hidroxitriptófano. Sin embargo, en microorganismos no está claramente definida su ruta metabólica de síntesis. En el caso de las levaduras, el metabolismo del triptófano produce asimismo el ácido indolacético y el triptofol, derivados de la ruta de Ehrlich. Las técnicas analíticas para cuantificar melatonina en fluidos biológicos y alimentos abarcan desde el radioinmunoensayo, en el que destaca la técnica ELISA, hasta las técnicas de cromatografía líquida de alta resolución con detectores de masas de última generación. El principal reto es poder detectar y cuantificar concentraciones a nivel de traza. Las primeras han demostrado ser eficaces en fluidos biológicos como el plasma o la saliva. No obstante, cuando se han aplicado a matrices alimentarias, los resultados han sido dispares, hecho motivado por posibles interferentes de la compleja matriz alimentaria que puedan reaccionan con los anticuerpos utilizados en el ELISA. Por ello, la Cromatografía Líquida de Alta Resolución ha mostrado ser la mejor alternativa para el análisis de melatonina y de otros compuestos derivados del aminoácido triptófano. En un principio, se desarrollaron métodos de cromatografía líquida con detectores de fluorescencia, pero debido a las bajas concentraciones de la melatonina en alimentos fermentados, los límites de detección y cuantificación de estos detectores fueron insuficientes para la identificación inequívoca de esta molécula. En la actualidad, la cromatografía acoplada a espectrómetros de masas parece ser la más indicada para el estudio de la melatonina. Sin embargo, la mayor parte de métodos publicados solo contemplan el análisis de la melatonina de forma aislada, por lo que no permiten ofrecer una visión global sobre su posible vía de formación en alimentos fermentados. La presente Tesis Doctoral tiene como uno de sus objetivos desarrollar un método cromatográfico acoplado a espectrometría de masas para identificar simultáneamente diferentes compuestos derivados del metabolismo del triptófano y relacionados con la ruta de síntesis de la melatonina. Además, se contempla el estudio de la estabilidad de estas moléculas frente al almacenamiento prolongado para comprobar el posible efecto matriz. Asimismo, se realizan diferentes ensayos de fermentación alcohólica tanto en mostos sintéticos como naturales a fin de seleccionar las levaduras con mayor capacidad de producción de compuestos indólicos derivados del triptófano. A su vez, se analizaron cervezas comerciales para dilucidar si en otras matrices distintas al vino se detectaba la presencia de compuestos indólicos. Asimismo, se han realizado estudios de bioactividad de compuestos estilbenoides, derivados del aminoácido fenilalanina y presentes en raspones de la vid (Vitis vinífera). Estos ensayos tienen como objetivo evaluar la capacidad de estos compuestos frente a la inhibición del proceso de angiogénesis, que en adultos está involucrado en la patogenia del cáncer y las enfermedades cardiovasculares, consideradas como las principales causas de muerte en el mundo, según los últimos datos de la OMS. Debido a que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es principal factor proangiogénico, la inhibición de VEGF es un mecanismo molecular plausible que demuestra una causa-efecto directa en la disminución del riesgo cardiovascular y de cáncer. Prueba del crucial rol de VEGF en la angiogénsis es el hecho de que ciertos fármacos frente al cáncer consisten en moléculas anti-VEGF, como el Avastin®. Sin embargo, debido al uso prolongado de las terapias anti-VEGF se han descrito serios efectos adversos, como hipertensión. Ciertos compuestos polifenólicos presentes en los alimentos como el galato de epicatequina, quercetina, entre otros, han demostrado poseer potencial anti-VEGF a la vez que activan la enzima óxido nítrico sintetasa endotelial (eNOS), responsable de la vasodilatación. Por tanto, se evaluó el potencial anti-VEGF de 12 compuestos de la familia de los estilbenos en una línea de células endoteliales de vena de cordón umbilical humano (HUVEC). Además, se determinó su efecto en la cascada de señalización intracelular, en concreto sobre las proteínas fosfolipasa gamma 1 (PLCγ1), responsable de la proliferación celular, la protein quinasa B (Akt) e eNOS. Los resultados más notables derivan del desarrollo de un método analítico validado que por primera vez identificaba simultáneamente nueve derivados del metabolismo del triptófano. Dicho método ha sido de utilidad para evaluar el posible efecto matriz de muestras fermentadas, dando por resultado que la cerveza es la matriz que sufre menos alteraciones en cuanto la composición de los compuestos indólicos, estableciendo como mejor temperatura de almacenamiento 4ºC. Las otras matrices probadas (vino, mosto sintético fermentado y extracto intracelular) fueron más inestables a lo largo del periodo de almacenamiento. Por otro lado, se confirmó la producción de melatonina y otros compuestos derivados del metabolismo del triptófano como la serotonina, el ácido 3-indolacético, triptofol y un ester etílico del triptófano durante la fermentación alcohólica de mostos sintéticos, resultando la cepa de levaduras Saccharomyces cerevisiae Aroma White la mayor productora de melatonina. Los resultados, además, fueron reproducibles en mostos de uva natural de distintas variedades de uva (Corredera, Chardonnay, Moscatel, Palomino Fino, Sauvignon Blanc, Tempranillo, Vijiriega), donde la levadura Aroma White volvió a ser la mayor productora de melatonina. A su vez, destaca la descripción por primera vez de uno de los intermediarios de la ruta de la melatonina, la N- cetilserotonina, en fermentaciones llevadas a cabo en mostos de la variedad Tempranillo. Además, se ha analizado el contenido de melatonina y otros compuestos indólicos en diferentes cervezas comerciales, entre los que destaca la identificación por primera vez de 5- hidroxitriptófano, N-acetilserotonina y ácido 3-indolacético. En cuanto a la bioactividad de estilbenos, se han seleccionado 5 compuestos (astringina, piceatanol, pallidol, ε- y ω-viniferina) capaces de inhibir VEGF (IC50 = 2,9-39,4 μM). Además, las dos viniferinas fueron capaces de inhibir PLCγ1 al mismo tiempo que activaron eNOS, por lo que cabría esperar que no presentaran el efecto hipertensivo asociado a los actuales fármacos anti-VEGF. Los resultados son sin duda de interés a fin de mejorar los procesos de vinificación para que estos compuestos de la vid y los sintetizados por las levaduras durante la fermentación estén presentes en el vino, dándole un valor añadido al producto final, y trasladando las prácticas a la fabricación de otras bebidas fermentadas como la cerveza.