Valoración de la respuesta inmunológica linfocitaria en pacientes con bronquiolitis agudaMedición de patrones de expresión génica, quimioquinas y receptores de quimioquinas

Resumen

1. Introducción La bronquiolitis aguda es una patología que se caracteriza por la inflamación bronquiolar durante una infección viral en un menor de dos años de edad; en la gran mayoría de los casos está provocada por el Virus Respiratorio Sincitial (VRS) y constituye la patología con mayor número de ingresos durante la época del lactante. Además, muchos de ellos requieren atención en la Unidad de Cuidados Intensivos Pediátricos (UCIP). No existe un tratamiento etiológico eficaz y las terapias médicas empleadas son de dudosa eficacia salvo el soporte respiratorio del paciente que lo precise. La respuesta inmune durante una bronquiolitis aguda se realiza en un primer momento a través de una reacción innata. Ésta es poco específica contra el patógeno que desencadenó el proceso y, además, muchos de los virus que provocan la bronquiolitis son capaces de evadirla. La respuesta inmune adaptativa es más específica y dirigida, por lo que se considera más eficaz que la respuesta innata. Aparece más tardíamente y es llevada a cabo principalmente por los Linfocititos tipo B y los Linfocitos tipo T. Estos últimos se subdividen en linfocitos tipo T citotóxicos (LTc, encargados del reconocimiento y destrucción de células infectadas) y de linfocitos tipo T helper [LTh, los cuales ejercen su función controlando la respuesta inmune contra patógenos intracelulares y en enfermedades autoinmunes en el caso de ser una respuesta tipo 1 (LTh1) y contra parásitos extracelulares o procesos alérgicos en el caso de los tipo 2(LTh2)]. Debido a la etiología viral de la bronquiolitis el sistema inmune debería resolverla a través de una respuesta inmune adaptativa, con un aumento de actividad de los LTc controlados por los LTh1. La llegada al organismo de cualquier agente infeccioso como sucede en cualquier bronquiolitis aguda no es suficiente para que las células antes mencionadas sean reclutadas al lugar donde son necesarias para ejercer su función. Para ello se requiere de un sistema de señalización capaz de ser reconocido por las células del sistema inmune, que les permita migrar a los órganos donde son requeridos. Una parte fundamental de este sistema de señalización es el sistema de Quimioquinas, una familia de citoquinas que ejercen su función atrayendo a las células del sistema inmune allí donde son segregadas. Esta familia está formada por más de 50 proteínas, que son reconocidas por otros tantos receptores de quimioquinas que se encuentran en la membrana de las células del sistema inmune. Muchas quimioquinas son específicas para ciertas células del sistema inmune de tal forma que el reclutamiento resultante va dirigido a unas células en concreto. Entre otras muchas sustancias, durante una bronquiolitis aguda se segregan quimioquinas de manera local con el objetivo de atraer a la vía aérea a las células del sistema inmune que se precisan en cada momento. De esta manera se cierra el círculo necesario para la activación del sistema inmune y se realiza el reclutamiento del celular a los órganos donde se está produciendo la infección. 2. Hipótesis Durante una bronquiolitis, la respuesta inmune –tanto el tipo como la potencia de la misma– influye en la gravedad del cuadro clínico. Teniendo esto en cuenta, el estudio inmunológico en el momento del ingreso de estos pacientes ayudará a diferenciar entre quienes presentan una evolución desfavorable y quienes desarrollan un cuadro clínico más benigno. 3. Objetivos El objetivo principal del presente estudio es describir la respuesta inmunológica linfocitaria tipo T en niños ingresados por bronquiolitis aguda en UCIP a través de la medición de patrones de expresión de citoquina, de receptores de quimioquinas y sus ligandos. Los objetivos secundarios son: 1. Analizar las características epidemiológicas y clínicas de los pacientes con bronquiolitis aguda que requieren ingreso en UCIP. 2. Conocer la evolución de los pacientes con bronquiolitis aguda que ingresan en UCIP en nuestro medio. 3. Analizar la relación entre el tipo de respuesta inmunitaria a cargo de los LT y los parámetros epidemiológicos, clínicos, analíticos y evolutivos en pacientes con bronquiolitis aguda ingresados en UCIP. 4. Analizar el patrón de expresión de receptores de quimioquinas específicos de LTh y sus ligandos y su asociación a alguna característica epidemiológica, clínica, analítica y evolutiva en pacientes con bronquiolitis aguda ingresados en UCIP. 4. Material y métodos Para llevar a cabo este trabajo se realizó un estudio prospectivo de los pacientes ingresados por bronquiolitis aguda en la UCIP del Hospital Infantil Universitario Niño Jesús durante la epidemia del Virus Respiratorio Sincitial (Noviembre 2012 a Febrero 2013). Tras la inclusión en el estudio se extrajo una muestra de sangre durante las primeras 24 horas de ingreso. Durante el ingreso se procedió a la recogida de datos epidemiológicos (fecha de nacimiento, sexo, fecha de ingreso hospitalario, fecha de ingreso en Cuidados Intensivos, fecha de alta de Cuidados Intensivos, fecha de alta hospitalaria, antecedentes personales de interés, procedencia del ingreso), clínicos (días de evolución de los síntomas, presencia de fiebre y/o apneas, gravedad de la bronquiolitis según la escala de Wood-Downes (WD) modificada por Farrés en el momento del ingreso), analíticos (leucocitos en sangre periférica, neutrófilos totales en sangre periférica, PCR y PCT en analítica realizada el ingreso, crecimiento en cultivos realizados y presencia de VRS en secreciones nasofaríngeas), terapéuticos (corticoterapia, antibioterapia, necesidad de soporte respiratorio y tipo, duración de dicho soporte) y evolutivos (éxitus durante el ingreso o necesidad de reingreso en UCIP, duración del ingreso) derivados de la práctica clínica habitual de la unidad. La muestra de sangre periférica obtenida se procesó para la recolección de células mononucleares del paciente y de plasma sanguíneo. El plasma se empleó para el estudio de las quimioquinas IP-10, MIG (específicas de respuestas LTh1) y TARC y MDC (específicas de respuestas LTh2) en sangre periférica mediante técnica de ELISA. Las células mononucleareas se emplearon en el estudio del inmunofenotipo linfocitario a través de la expresión génica de los marcadores CD4 (marcador de LTh), CD8 (marcador de LTc), INFγ (marcador clásico de LTh1), IL-4 (marcador clásico de LTh2), FOXP3 (marcadores de los LTh reguladores), CXCR3 (receptores específico de las quimioquinas IP-10 y MIG) y CCR4 (receptor específico de las quimioquinas TARC y MDC) mediante reacción en cadena de la polimerasa en tipo real (RTqPCR). Finalmente, se realizaron los estudios estadísticos necesarios para conocer las asociaciones entre los datos clínicos y experimentales obtenidos con el fin de llevar a cabo los objetivos anteriormente descritos. Dado que, en la mayoría de los casos, los datos obtenidos no seguían una distribución normal, se utilizaron preferentemente test no paramétricos para el análisis. Para valores independientes se empleó el test de la U de Mann-Withney (significación unilateral) para comparar dos categorías, mientras que la prueba de Kruskal-Wallis se empleó en el caso de más de tres categorías. Para las variables dependientes se determinó la normalidad de los datos mediante la prueba de Saphiro-Wilk. En el caso de que siguieran una distribución normal se empleó la t-Studen para datos independientes y el test de Wilcoxon en el caso contrario. Para el análisis de correlaciones entre variables cuantitativas se realizó el coeficiente de correlación de Pearson. Se consideró una diferencia significativa aquella en el que el valor de p fuera igual o menor de 0,05. 5. Resultados Durante el periodo estudiado se obtuvo una muestra de 49 pacientes con una mediana de edad de 35 días; el 63% eran varones. La mayoría de los pacientes no presentaba antecedentes de interés para el desarrollo de una bronquiolitis grave (71%). La media de gravedad de la bronquiolitis según la escala de Wood-Downes fue de 7 puntos. En el 96% de los pacientes se detectó VRS en secreciones nasales y la mayoría de los pacientes mostraba datos analíticos compatibles con infección viral. El soporte respiratorio empleado en la mayoría de los casos fue la ventilación no invasiva (76%) con una mediana de duración del soporte respiratorio de 88 horas. La evolución de los pacientes fue favorable. Precisaron una mediana de ingreso de 5 días y no falleció ningún paciente durante el estudio. Los ingresos prolongados (más de 5 días) correspondían a pacientes de menor edad (34 vs 163 días, p=0,002). Además, estos pacientes con ingresos más prolongados eran aquellos con menor contaje de leucocitos totales en sangre periférica (7.742/µL vs 12.941/µL; p<0,0001). Los pacientes con antecedentes personales eran de mayor edad (209,4 vs 71,1 días, p=0,05). El ser menor de 3 meses condicionaba ingresos más prolongados (6,3 vs 3,6 días, p=0,004) y más horas de soporte respiratorio (126 vs 72 horas, p=0,002). El estudio mediante RTqPCR mostró un inmunofenotipo predomínate de LTc respecto a LTh en el 87% de los pacientes, con una mediana al realizar el índice entre CD8/CD4 de 2,7. Respecto al tipo de respuesta LTh, el análisis de INFγ e IL-4 mostró una preferencia individual hacia el primero en el 97% de los pacientes con una mediana del índice entre ambos de 15, lo que revela una preferencia de respuesta LTh1. Al analizar el tipo de respuesta LTh a través de los receptores de quimioquinas CXCR3 y CCR4, el 97% de los pacientes mostraba una mayor expresión del segundo lo que condicionaría un tipo de respuesta LTh2. La mediana del índice entre ambos marcadores fue 0,41. El análisis del valor de las quimioquinas y sus receptores mostró una correlación entre TARC y MDC (0,591; p<0,0001) y entre CXCR3 y CCR4 (0,473; p=0,001) en sangre periférica. También se encontraron correlaciones significativas entre expresión génica de CD4 con CD8 (0,336, p=0,021), FOXP3 (0,719; p<0,0001) e IL-4 (0,416; p=0,004), de CD8 con FOXP3 (0,354; p=0,015), de FOXP3 con IFNγ (0,482; p=0,001) e IL-4 (0,836; p<0,0001) Los niveles de expresión de IFNγ e IL-4 se correlacionaban entre ellos (0,676; p<0,0001). Los pacientes con bronquiolitis moderada según la escala de Wood-Downes fueron aquellos con mayor expresión génica de CCR4 (30,9 vs 24,6, p=0,002), aunque este hallazgo no se encontró en sus quimioquinas específicas. Entre los datos evolutivos destaca la relación entre los valores de TARC y MDC con la duración del ingreso y del soporte respiratorio. Valores elevados de ambos marcadores en el momento del ingreso permiten predecir ingresos más cortos que aquellos que presentan valores bajos. Los pacientes con leucocitosis presentaban un aumento tanto en la expresión de CD4 (17,2 vs 12,1; p=0,041) como en el valor de MIG (10.164 pg/mL vs 6.341 pg/mL; p=0,035). En los pacientes con sospecha o confirmación de sobreinfección bacteriana presentaban mayor expresión génica de INFγ (67 vs 25,6, p=0,04). 6. Conclusiones Durante una bronquiolitis aguda grave se produce una activación inmunológica caracterizada por una intensa respuesta a cargo de los LTc y un balance de LTh preferente hacia LTh1; además, los pacientes con mayor masa leucocitaria circulante en sangre periférica requieren más actividad de los LTh para el control de la homeostasis inmunitaria. La respuesta LTh1 que aparece durante una bronquiolitis aguda se caracterizada por una mayor expresión en sangre periférica de INFγ que de IL-4. La mayor expresión de INFγ se relaciona con la posibilidad de una sobreinfección bacteriana. Sin embargo, al medir el tipo de respuesta LTh a través de receptores de quimioquinas, la expresión preferencial fue de CCR4, característico de respuestas LTh2. El valor cuantitativo de las quimioquinas IP-10, MDC, TARC y MIG no se relaciona con la expresión de sus receptores (CXCR3 y CCR4) en sangre periférica durante una bronquiolitis aguda grave. El valor de las quimioquinas TARC y MDC en el momento del ingreso se relaciona con el pronóstico de los pacientes con bronquiolitis aguda grave al existir una relación entre estos valores y la duración del ingreso en UCIP.