Señalización celular en cáncer de próstatainterrelación del vip y otros péptidos activos con la familia her

Zusammenfassung

En este trabajo de investigación se han utilizado tres modelos experimentales para estudiar la interacción de las rutas de señalización acopladas a los receptores GPCRs y HER. En células epiteliales tumorales de próstata humana, LNCaP y PC-3, se ha estudiado el papel mitogénico y de supervivencia del péptido intestinal vasoactivo (VIP) y la bombesina (BN), y la inhibición de su efecto por distintos antagonistas y citotóxicos, así como los mecanismos por los que el VIP modifica la expresión y promueve la transactivación de los receptores de la familia HER. El modelo de ratones se utiliza para observar cómo el VIP induce los tumores que son inhibidos por el antagonista JV-1-53, y en tejido humano se estudia la expresión y activación de HER. El cáncer de próstata es la segunda causa de muerte por cáncer en el hombre occidental. El neuropéptido VIP, tiene una amplia distribución en el sistema nervioso central y periférico. Los efectos biológicos del VIP están mediados a través de receptores GPCRs. Nuestro grupo de investigación ha sugerido que el neuropéptido está envuelto en la progresión del cáncer de próstata. JV-1-51, JV-1-52 y JV-1-53, son análogos antagonistas de GHRH, siendo el JV-1-53 el más específico de VIP, sintetizados y cedidos por el grupo del Dr. A.V. Schally, de la Universidad de Miami. Por otro lado, la BN y GRP son capaces de estimular el crecimiento in vivo e in vitro del cáncer de próstata, a través del receptor GRPR, sobre-expresado en cáncer de próstata. Por ello, se utiliza un análogo citotóxico de BN AN-215, que consiste en la 2-pirrolinodoxorubicina (AN-201) unida al antagonista de BN RC-3095, agentes cedidos también por el Dr. A. V. Schally. Nuestros resultados confirmaron mediante ensayos de MTT, que los antagonistas JV-1-51, JV-1-52 y JV-1-53, bloquearon el aumento en la viabilidad celular inducido por VIP, en células LNCaP y PC-3. De éstos, JV-1-53 mostró el efecto más específico. Por otro lado, los agentes AN-215 y RC-3095 inhibieron el efecto positivo de la BN sobre la viabilidad celular en ambas líneas celulares, siendo el radical citotóxico AN-201 inefectivo. Los receptores tirosina quinasa de la familia HER están implicados en el desarrollo del cáncer de próstata, y están formados por cuatro miembros homólogos: EGFR, HER-2, HER-3 y HER-4. Mediante RT-PCR cuantitativa (RT-PCRQ) y semicuantitiva, y "Western Blot", se mostró que los niveles basales tanto del ARNm como de la proteína para HER-2 y -3, eran mayores en las células tumorales LNCaP y PC-3 que en la línea no tumoral RWPE-1, a excepción del EGFR. Del mismo modo, VIP reveló un aumento tanto en los niveles de mensajero como de proteína de EGFR, HER-2 y HER-3 implicados en la transformación oncogénica. Además, por ensayos de Inmunocitoquímica y "Western Blot" se observó que VIP aumentaba la fosforilación de EGFR y de HER-2, a los 5 y 45 min, y 2 h en LNCaP, y a los 30 s y 30 min en células PC-3. Debido a que HER-2 está implicado en el desarrollo de la independencia androgénica, se eligió para estudiar el mecanismo de acción a través del cual VIP aumenta su activación. Por "Western Blot" se demostró que el VIP ejerce sus efectos a través de sus receptores de membrana, debido a que su efecto en la activación de HER-2 fue bloqueado a todos los tiempos estudiados por el antagonista de VIP, JV-1-53. Esto supone un posible potencial terapéutico para el cáncer de próstata. Además, este efecto del VIP implicó a la PKA, por la inhibición de la activación de HER-2 tras el tratamiento con H-89. El tratamiento con EGF resultó en la activación de HER-2, que implicaría la formación del heterodímero EGFR-HER-2 en las dos líneas celulares. Mediante "Western Blot" se encontró que EGFR estaba asociado en la transactivación de HER-2 en células PC-3 y en el caso de las 2 h en LNCaP. Además, la inhibición de Src, bloqueó la transactivación de HER-2 inducida por VIP, a excepción del caso de la transactivación a las 2 h en células LNCaP, y se demostró la implicación de la familia de las ADAMs en dicha activación de HER-2, en ambas líneas celulares. Nuestro grupo había demostrado que VIP ejercía un efecto pro-angiogénico en un modelo in vivo de cáncer de próstata experimental, inducido con células LNCaP. En nuestro estudio, el tratamiento con VIP durante 5 min en células LNCaP antes de su inyección en el flanco izquierdo de ratones desnudos atímicos, produjo un aumento en el volumen del tumor, la activación de HER-2 y en el nivel proliferativo de los tumores de los ratones, medidos por "Western Blot" e Inmunohistoquímica. Todos estos efectos se mostraron inhibidos en el caso del grupo inoculado con las células preincubadas con JV-1-53 durante 30 min antes del tratamiento con el VIP. Mediante RT-PCR semicuantitativa se observó que los niveles basales del mensajero de GRPRh eran superiores en las células tumorales, que en la no tumoral, y sus valores crecían conforme aumentaba la agresividad de la línea celular. La inmunodetección con "Western Blot" e Inmunocitoquímica reveló que el tratamiento con el agente citotóxico conjugado AN-215 y el antagonista de BN RC-3095, disminuyeron la fosforilación de EGFR y HER-2, y los niveles de expresión de HER-3. Además, AN-215 no tuvo efecto sobre HER-2, ni el RC-3095 sobre EGFR. El radical citotóxico AN-201 resultó inefectivo. En último lugar, se analizaron las diferencias entre EGFR y HER-2, envueltos en un peor pronóstico en el cáncer de próstata, y del HER-4, implicado en un mejor pronóstico. La RT-PCRQ mostró que los pacientes con tumor tuvieron niveles mayores de mensajero de EGFR y HER-2 que de HER-4, con respecto a los pacientes control. Además, en los pacientes con tumor en estadio pT2 y pT3, la expresión del ARNm de HER-2 y EGFR fue mayor que los pacientes control; sin embargo, la expresión del ARNm de HER-4 no aumentó conforme al estadio del tumor. Ensayos de "Western Blot" e Inmunohistoquímica revelaron un marcaje de la activación de HER-2 y EGFR citoplasmático y de membrana, siendo la activación de HER-2 mayor en la fracción de membrana y citosólica de los pacientes con tumor respecto de los pacientes control. En conclusión, mostramos la capacidad inhibitoria del JV-1-53 y de los agentes AN-215 y RC-3095, sobre los efectos del VIP y de la BN en la viabilidad celular. Además, VIP aumenta la expresión y activación de los miembros de la familia HER, induciendo la transactivación de HER-2 a través de la PKA, Src, EGFR y las ADAMs. Estos resultados, sumados al papel mitogénico y de supervivencia del neuropéptido, nos hacen proponer al VIP como un biomarcador para posibles estrategias terapéuticas, combinadas con terapias a nivel de los receptores tirosina quinasa en el cáncer de próstata.