Bases celulares y subcelulares que median la interacción entre los canales de potasio girk y los receptores de gabab en el cerebelo

Resumen

En el presente trabajo de investigación hemos empleado técnicas bioquímicas, funcionales y morfológicas de microscopía óptica convencional, microscopía láser confocal y microscopía electrónica de alta resolución, en combinación con aproximaciones metodológicas, para determinar los patrones de expresión de los canales de potasio GIRK en el sistema nervioso central en roedores adultos y durante el desarrollo postnatal, la interacción molecular y funcional de los canales GIRK con los receptores de GABAB, y poner de manifiesto la localización celular y subcelular del receptor y su canal iónico efector en el cerebro. Mediante el uso de técnicas de histoblot, observamos que los patrones de distribución regional de las subunidades GIRK1, GIRK2 y GIRK3 son similares y solapables, tanto en adulto como durante el desarrollo postnatal, mostrando niveles de expresión altos para dichas subunidades en la neocorteza, hipocampo, cerebelo y tálamo. Observamos que los patrones de expresión de las subunidades GIRK1, GIRK2 y GIRK3 son dependientes de la región nerviosa, y paralela a la expresión durante el desarrollo del receptor de GABAB que las activa. Mediante el uso de técnicas de FRET comprobamos que los receptores de GABAB interaccionan directamente con heterotetrámeros GIRK1/GIRK3 en sistemas de expresión e in vivo. Además, mediante técnicas de inmunofluorescencia en cultivos celulares, demostramos que los complejos macromoleculares que contienen los receptores de GABAB y los canales GIRK se forman poco después de su biosíntesis, probablemente en el retículo endoplásmico y/o en el complejo retículo endoplásmico/aparato de Golgi, sugiriendo que podría ser una característica general de la transducción de la señal de los canales iónicos. Mediante el uso de técnicas de co-inmunoprecipitación hemos comprobado que las subunidades GIRK1, GIRK2 y GIRK3 forman complejos macromoleculares con los receptores de GABAB en el cerebelo. El empleo de técnicas de microscopía electrónica de alta resolución combinado con análisis cuantitativo nos ha permito poner de manifiesto que la composición de subunidades de los canales GIRK en las células de Purkinje es dependiente del compartimento subcelular. De esta forma, en la membrana extrasináptica de las espinas dendríticas, los canales GIRK podrían estar formados por las subunidades GIRK1/GIRK2/GIRK3, los troncos dendríticos parecen contener GIRK1/GIRK3, mientras que las densidades postsinápticas de las células de Purkinje contendrían principalmente GIRK2/GIRK3. Además, las tres subunidades colocalizan con los receptores de GABAB, tanto a nivel post- como pre-sináptico. Estudios funcionales con sinaptosomas de cerebelo nos ha permitido demostrar por primera vez la asociación funcional de los canales GIRK y los receptores de GABAB en las terminales axónicas, poniendo de manifiesto su papel en la inhibición de la liberación de glutamato liberado desde las fibras paralelas. Finalmente, los canales GIRK son dianas moleculares de la acción de drogas como la cocaína. La ausencia de los canales GIRK en neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo determina hiperactividad e incremento de las respuestas motoras inducidas por cocaína debido al debilitamiento de los mecanismos de retroalimentación inhibitoria. Esto se debe a que los canales GIRK median los efectos inhibitorios postsinápticos relacionados con los receptores de GABAB y la activación de los receptores D2.